圖片1.jpg

    在上述文章中有提到,核酸萃取的方法有很多中,常見的有:試劑萃取管柱萃取以及磁珠萃取,今天主要介紹試劑萃取,試劑萃取又因溶劑的不同,分作有機溶劑萃取與非有機溶劑萃取。

其基本原理如下[1]

    DNA為一個容易變性或斷裂的巨分子,而細胞內的DNA水解酶更會破壞其結構,因此在萃取DNA時,會將細胞溶解後置於相似細胞環境的緩衝溶液中,透過金屬螯合劑降低DNA水解酶的活性,再利用蛋白變性劑將附著在DNA上的蛋白分開,接著透過有機溶劑(或無機溶劑)去除蛋白質及其他雜質(圖一),因DNA具親水性而不溶於有機溶劑(如:phenol/chloroform)中,因此可以透過分層,主要分三層,包含水層(DNA)、蛋白質及有機溶液層(圖二),而萃取出DNA [1]

圖片2.jpg

圖一、利用有機溶劑去除雜質[2]

圖片3.jpg

圖二、利用phenol:chloroform萃取後的分層[2]

有機溶劑萃取主要的步驟如下[1]

    將細胞溶解後,加入DNA萃取緩衝液(DNA extraction buffer)及蛋白水解酶K (proteinase K),於65℃反應3~4個小時,接著於室溫下再加入PCI (phenol:chloroform : IAA = 25:24:1)讓萃取物分層,緩慢上下混合5分鐘,再以13000 rpm轉速離心5分鐘(25℃),取上清液至新的eppendorf,再加入PCI緩慢上下混合均勻5分鐘,以13000 rpm轉速離心5分鐘(25℃),取上清液再加入CI (chloroform:IAA = 24:1 ) 緩慢上下翻轉5 min,以13000 rpm轉速離心5分鐘(4℃),取上清液置入新的eppendorf後加入NaOAcisopropanol的混合液,置於-80℃中靜置3小時以上,再以13000 rpm轉速離心30分鐘(4℃),移除上清液,再加入70 % EtOH,以13000 rpm轉速離心5分鐘(4℃),移除上清液置於烘箱烘乾,最後加入ddH2O,置於60℃環境中10分鐘,讓DNA完全溶解,萃取純化後的檢體最後保存於-20℃[1]

    上述的過程看不懂沒關係,大概只要知道有機溶劑萃取的過程又複雜又耗時,因此陸續發展出其他萃取的方式,如:管柱萃取磁珠萃取等,做個簡單表格比較有機、管柱、磁珠各別的萃取系統間的差異性(表一):

圖片4.jpg

表一、比較不同系統間的差異

    因此大家是不是更懂得不同核酸萃取方法之間的差異,隨著科技的進步,核酸萃取的步驟更簡化、更省時間、也減少對身體的傷害及環境的汙染,甚至更有自動化的儀器,只要按個鈕,機器自己幫你做全部的工作,真的實在越來越厲害了。

參考資料:
1. http://zh.biology.wikia.com/wiki/DNA_%E8%90%83%E5%8F%96%E5%AF%A6%E9%A9%97?variant=zh-tw
2. http://slidesplayer.com/slide/11646737/

 

基因叔叔 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()