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       腸道菌叢(Gut Microbiota)主要指棲息在人體腸道內的龐大數目之細菌族群。正常情形下,預估超過 1014的菌群居住於腸胃道,因此其對於人體的各種生理及病理現象影響相當明顯且重要。

       微生物相(microbiota)泛指「一群」棲息在植物或動物體內部與表層,或是環境中(例如土壤、深海、居住物等),肉眼看不見的微小生物。這些微小生物包括了細菌、真菌、病毒或原生生物,其與宿主之間發展出互利共生(symbiosis)、片利共生(commensalism)或致病(pathogenesis)關係。另一方面,隨著分子生物學的巨大進展,科學家觀察微生物相的角度,從過往的培養盤篩選,得以從基因或從更細部的DNA序列進行分析。微生物體(microbiome)是以「基因體」為角度論述微生物相即可稱為微生物體。

       人類微生物群是生活在人體表面和體內的全部微生物集合體,其對人體生理學、免疫系統發展、消化和解毒反應非常重要。存在於腸道中的微生物,參與了與宿主健康有關的重要蛋白之編碼,如水解不易消化的膳食化合物所需的酶以及維生素的合成。人體中有兩個基因組,一個來自父母遺傳,另一個則是來是微生物群,這兩基因組織間的區別在於遺傳基因組在生命中幾乎保持穩定,但微生物群則是非常動態的,並且可能受到多種因素的影響如:年齡、飲食、激素週期、旅行、治療和疾病。

       因此,當我們更了解健康各體中微生物的組成和功能,以及人類腸道微生物菌群改變對疾病發展的影響,就可利用微生物體(microbiome)作為診斷和治療應用的新標的

       在過去的十年中,次世代定序(NGS)技術的迅速發展,這種技術在降低定序成本的同時增加了核酸定序/運行鹼基的通量,對總體基因體學 (Metagenomics) 領域產生了重大影響。事實上,使用NGS的方法可以對特定的微生物組表徵進行深入定性和定量,而不會受到與培養方法相關的選擇偏差和限制。這些技術也被用於人類微生物組計劃,其目的是獲得生活在人體各個地區微生物的完整目錄並確定其功能。以下為利用NGS分析總體基因體學 (Metagenomics) 之研究策略:

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圖一、總體基因體學之研究策略
 

  • 霰彈槍定序法 (Shotgun sequencing)

       將DNA序列打成許多數百核苷酸長度的DNA片段,接下來以序列產出(Sequence production)將DNA片段標示後頭尾比對整理,最後藉著聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)、引子移步(primer walking),基因圖譜繪製等技術把DNA片段順序做正確的排列,並補齊缺失以還原成完整的DNA序列。

       由於目前可作為參考數據庫是受限制的正確分配序列讀取通常是困難的;此外,特別是在不太豐富或密切相關的物種的情況下,基因組比對或在DNA萃取的方法會產生一些誤差。

 

  • 16S rRNA 定序 (16S rRNA sequencing)

       16S rRNA 定序是一種基於微生物16S rRNA 高度變異區的序列進行環境微生物菌群組成、菌種豐富度分析以及菌種鑑定的技術。其特色為將環境樣品中微量且複雜的基因體序列,透過PCR專一性的放大16S rRNA 高度變異區的序列再透過NGS進行定序與分析,而NGS能同時檢測大量的環境樣品並且能快速且精準地提供環境微生物的菌種鑑定與菌種豐富度等資訊。

       儘管16S rRNA 定序容易執行、快速且相對便宜但在萃取RNA過程可能會有誤差,進而使結果可能有所偏差。此外,在相同情況下,參考數據庫的準確性也會影響其分析結果。

 

  • 總體轉錄體 (Metatranscriptome)

       總體轉錄體定序 (Metatranscriptome sequencing) 是一種直接將環境樣品中微量且複雜的所有轉錄體序列 (transcriptome) 透過NGS進行檢測再將定序獲得的序列進行轉錄體序列組裝 (transcriptome de novo assembly) 藉以獲得相對完整的微生物與真菌轉錄體序列並透過一系列的生物資訊分析確認轉錄體序列組成與轉錄產物相對豐富度,同時提供轉錄產物功能註解 (Functional annotations) 的技術平台。透過總體轉錄體定序,研究者可以快速的了解特定的環境中具有那些微生物與真菌以及該處的微生物與真菌具有那些特定的基因功能。而影響總體轉錄體定序的因素包括RNA萃取、保存、品質及數量等相關技術問題;此外,取樣環境的汙染物可能會影響實驗結果,目前使用的rRNA純化方法並無法去除。最後,對於Metatranscriptomic數據分析生物信息學工具仍在開發中。

 

       在本研究中,我們只簡要提及一些與此問題有關的最相關數據。事實上,由於腸道微生物組在健康成年期似乎幾乎是穩定的,因此其定性和定量改變導致了功能改變,已經在許多人類疾病中報導。特別是,微生物豐富性通常被認為是健康狀態的指標:減少的細菌多樣性與肥胖、免疫及發炎相關疾病有關。此外,由於許多生理功能需要健康的微生物組合物,因此定性改變,特別是在核心微生物組的水平上,可導致疾病的發展。這種現象主要在發炎性腸道疾病(IBD)中進行研究,包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎。發炎性腸道疾病(IBD)是胃腸道的慢性復發性疾病,由遺傳和環境因素(包括腸道微生物群)的組合引起;許多研究報導指出,IBD患者與未患病個體相比腸道微生物組成有顯著改變。不僅IBD患者的擬桿菌,變形桿菌和厚壁菌定殖率有所改變,但其微生物組的細菌多樣性通常低於對照組。在這種情況下,我們在克羅恩病患者的診斷和營養療法後,發現消化道發炎的特徵與16S rRNA迴腸相關的微生物群減少,並發現通過營養療法恢復了微生物平衡。另外,肥胖和非肥胖受試者之間腸道微生物組的差異也有廣泛研究。儘管人們知道腸道微生物群和腸道通透性的改變,可以誘發典型的肥胖症的發炎狀態,但特定的微生物變化及其作用機制仍不清楚。當我們了解了腸道菌群及其功能時,我們能更好地理解許多疾病的潛在機制,以及如何將微生物群本身用作診斷和/或預後生物標誌物。同樣地,更深入了解腸道微生物群將使我們能夠在個人化的醫學環境中開發新的治療策略。

 

 

 

 

Golden叔叔

 

 

 

Reference

  1. Valeria D’Argenio and Francesco Salvatore, Clinica Chimica Acta, The role of the gut microbiome in the healthy adult status, 2015, 451:97-102
  2. http://enews.nhri.org.tw/enews_list_new2_more.php?volume_indx=733&showx=showarticle&article_indx=12110
  3. http://gims.tmu.edu.tw/files/news/119_db520686.pdf
  4. http://welgene.pixnet.net/blog/post/24185637-%5Bngs%5D-%E6%AC%A1%E4%B8%96%E4%BB%A3%E5%AE%9A%E5%BA%8F%E5%9F%BA%E6%9C%AC%E6%A6%82%E5%BF%B5-%28basic-concepts-of-ngs%29
  5. https://investigatortw.wordpress.com/2013/11/17/bioinformatics-1/
  6. http://www.sequencing-tech.com/content/%E7%B8%BD%E9%AB%94%E8%BD%89%E9%8C%84%E9%AB%94%E5%88%86%E6%9E%90-metatranscriptomics-analysis

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