基因叔叔：科普、期刊導讀(Uncle Gene)

       美國腸道計畫 (American Gut Project) 是一個由Rob Knight和Jeff Leach共同創立的公民科學計畫，此計畫目的在於探究人類微生物組 (Human microbiome)，也就是從體表至體內所有存在的細菌含量多寡及其可能代表的涵義。你知道微生物細胞數與人體細胞數是以超過10:1的比例存在著嗎？而且我們身旁還有許多有機體 (organisms)，到目前還是未知的。

微生物組的組成會因人及體內位置而異，具有其獨特的微生物菌群，並且可能隨時間產生不同變化，這也就意味著需要大量的數據才能有效的研究微生物組。因此，此計畫收集所有參與者的微生物定序、健康程度及生活方式等資訊，並透過歐洲生物信息學研究所 (European Bioinformatics Institute) 公布，以提供全世界所有研究人員能夠藉由美國腸道數據提出突破性問題。

為什麼研究微生物組 (Human microbiome) 這麼重要呢？

       至今，有些許研究結果將某些趨勢與肥胖、飲食類型以及季節差異做聯想，但微生物組如何影響人類健康的具體方式仍是不清楚的！雖然在辨別與我們共存的微生物已有一大進展，但這些微生物在體內做些什麼、微生物如何與我們身體相互作用、微生物如何影響我們的健康，這些都是尚未觸及的神祕領域。

如何參與此計畫呢？

    全基因組定序（Whole genome sequencing, WGS）為對單一生物體基因組做完整DNA序列的過程，其中包含了生物體的染色體DNA、粒線體DNA及植物葉綠體DNA等，目前全基因組定序被廣泛地用作研究工具，並且在未來也會應用在個人化醫療作為診斷的依據^[1]。

    在過去人類基因體計畫(The Human Genome Project, HGP)將人類全基因組做解碼進而開啟基因與疾病間研究的大門，在科技的日新月異，越來越多的定序技術與儀器(如：NGS)問世，更全面且更深入地進行基因研究，透過短序列 (Short-Reads)、雙末端 (Paired-Ends)和不同長度的插入片段 (Insert-Size)相互結合搭配進行策略性的定序，各別可做單一核苷酸多型性 (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)、插入與缺失 (Insertions and Deletions, INDEL)、染色體結構變異 (Structure Variations, SVs)及拷貝數變異 (Copy Number Variations, CNVs）等基因序列變異的分析，同時也能夠偵測DNA甲基化的表觀遺傳學 (Epigenetic)變異^[2]，並且透過資訊工程的分析及比對，藉此應用於疾病檢測、預防醫學以及個人化醫療的領域中。

    由上述可知，基因定序為研究基因的最初始關鍵，而根據定序的目標包含：全基因、外顯子及特定目標基因，又可細分成Whole genome sequencing、Whole Exome Sequencing、Targeted Sequencing^[2]。

統整其特性如下表：

圖一、比較不同定序方式   

    全外顯子定序(whole exome sequence, WES)在臨床上能夠快速作為單基因突變所導致的疾病檢測，同時在研究領域中更被用於探討多基因突變的複雜疾病，像是腫瘤、糖尿病及高血壓等。美國國家衛生研究院(NIH)心肺血液研究單位更是利用外顯子定序計畫(Exome Sequencing Project，ESP)探討基因與心肺及心血管相關疾病間的關聯性、功能及機制。另外，美國癌症基因體圖譜計畫TCGA (The Cancer Genome Atlas )與國際癌症基因組聯盟ICGC (International Cancer Genome Consortium)也都透過外顯子定序等定序技術及生物資訊分析，探討癌症相關致病基因及位點的變化^[1]。

那什麼是全外顯子定序(whole exome sequence, WES)？

    顧名思義就是將全部的外顯子做定序，那為什麼要這麼做呢？人類基因體(Genome)大約有30億個鹼基對，總共約有23000個基因，而其能轉譯成蛋白質的外顯子(exome)含有18萬個，共有3000萬個鹼基對占人體全部鹼基對的1%，目前科學證實，大多數DNA突變引起的疾病(約有85%)都發生在外顯子區域的序列變異^[2,3]，因此全外顯子定序(whole exome sequence, WES)相對於全基因組定序(whole genome sequence, WGS)雖然不能完整得到基因資訊，但卻更加經濟及高檢測覆蓋率^[4]。

圖一、基因突變會導致疾病發生

    外顯子定序能檢測不同的外顯子組序列變異，包含：單核甘酸變異(single nucleotide variants, SNVs)、插入或刪除短片段變異(insert or delete short segment, InDels)、及拷貝數變異(copy number variations, CNVs)等，同時搭配已知文獻中的生物資訊分析、線上資料庫工具做系統性地分析彙整，依序進行序列比對(Map)、序列異變分析(Variant Analysis)、探討可能的異變及其功能、重要性與生物意義等，提供一個完整的基因突變研究方法^[4]。

       於先前文章「什麼是腸道菌相(human gut microbiota)？」提及，新生兒從一離開母體接觸到外界，就開始培養屬於自己的腸道菌，其中有99%就坐落於腸道之中，其中影響菌相組成的因素包含：母體的健康及營養、分娩方式、有無使用抗生素、新生兒喝母乳或配方奶，以及何時開始斷奶並食用固體食物。

       現今大多數都研究新生兒前6個月的腸道菌相，然而，針對新生兒晚期 (1-3歲)的研究則很少。為了更進一步的了解新生兒晚期的腸道菌相變化，本篇以澳洲52位1歲的嬰兒作為研究對象，探討分娩方式、有無使用抗生素和有無餵母乳是否會影響嬰兒晚期腸道菌相的組成。

餵食內容及方式

圖一、不同餵養方式及其比例

       52位嬰兒在出生後第一個月有81%單餵母乳、15%母乳+配方奶以及4%單餵配方奶；至第12個月時，餵食方式有所改變，母乳+固體食物、母乳+配方奶+固體食物都佔21%，配方奶+固體食物則有30%，其中開始嘗試給予固體食物的平均時間約在嬰兒5個月大的時候。

    生物標記包含DNA、RNA以及蛋白質，可用於分析細胞的功能、臨床疾病診斷並且幫助醫生選擇治療方式。其中，用以評估個體動態基因表達的改變，RNA為最理想的指標^[1]。

    在檢測技術日新月異，過去原位RNA檢測技術（ISH和FISH）已發展多年，但這些技術在特殊檢體上還是有許多的局限存在。例如它們缺乏可靠性和靈敏度，用以準確地檢測大多數人類基因的表達。此外，微陣列(Microarray)與PCR技術是常用於分子診斷分析的標準分子檢測方法，但是在這些技術最大的問題就在於只能偵測含量多寡，但無法偵測整體細胞或組織的臨床信息以及表達分佈情形。

    為解決這些問題，ACD (Advanced Cell Diagnostics Inc., Hayward, CA)開發了RNAscope®  in situ hybridization (ISH)，透過獨特探針和放大信號的新型核酸原位雜交染色技術，可以取代傳統ISH/FISH RNA原位檢測 ^[2]，此技術幾乎能夠設計出所有物種的目標探針並且提供性能的保證，而其探針製造只需要兩週以內的時間，比起全新抗體製造，所需要的時間少了很多，另外，透過雙Z探針設計，RNAscope® ISH能夠放大訊號提高偵測靈敏度並且降低來自非特異性雜交的背景干擾^[1]。

RNAscope® ISH的操作原理及步驟如下^[2]：

1、透化

       在新生兒先天性疾病中，聽力缺損是最常見的疾病之一。先天性聽力障礙可分為傳導性聽損和感覺神經性聽損，傳導性聽損是由外耳或中耳缺陷所構成，會導致聲音的傳導受阻；而感覺神經性則是因為內耳或神經路徑的感覺系統出現問題所造成。根據國內研究統計，台灣新生兒患有先天性雙耳中重度聽障的發生率約為1/1000~3/1000，而感覺神經性聽損在兒童總人口數中則有1%~5%，其中約有三分之二為遺傳基因導致。值得注意的是，超過90% 聽損新生兒的父母親聽力都是正常的。

聽力受損對寶寶或兒童會產生什麼影響呢？

       研究顯示，輕、中度聽損的寶寶的黃金矯正其在六個月大之前，對於語言學習會有顯著幫助；反之，若延遲至六個月後才予以診斷，可能會造成語言和社交能力發展的明顯遲緩。

       另外，根據統計顯示，重度聽損診斷出來的年紀平均為1歲半，中、輕度聽損則為3歲半至4歲，都已錯過語言學習之關鍵時期。因為嬰幼兒聽語發展之黃金時段是在3歲以前，剛出生的嬰兒，其週邊的耳蝸雖已發育完整，但大腦聽覺中樞是在出生後，不斷受環境的聲音刺激，才得以發育完成。換言之，3歲以後人腦的可塑性逐漸變差，大腦中原先被設計用於聽力、語言的細胞逐漸轉變成其他用途，故此時要再讓它恢復原有的聽語功能，就相當困難。然而，傳統的聽力檢查有侷限性，無法檢測出輕度與晚發性聽損，因此大多會建議父母親加做新生兒聽損基因檢測。

與新生兒感覺神經性聽損相關的基因變異有哪些呢？

    在介紹接續式細胞共同培養容器(ICCP)前先介紹什麼是細胞培養，細胞培養(cell culture)是在特定控制條件下，真核生物或原核生物細胞在體外環境生長的過程^[1]，其培養過程可以給予不同環境因子刺激而產生不同的細胞生理作用。

    人體是個複雜的環境，細胞與細胞的交互作用能夠活化或調控細胞下游的訊息傳遞，進一步打開/關閉基因途徑或細胞生長分化等細胞生理作用。其中細胞與細胞間的交互作用主要分成兩個形式，第一種為細胞與細胞之間直接接觸，第二種為細胞之間間接接觸，透過細胞分泌細胞激素、賀爾蒙或外排體等來刺激另一個細胞的過程。

細胞共同培養是在相同環境中直接或間接培養多種不同種類細胞的過程。因此細胞與細胞間的共同培養相關實驗需要透過：(1)將細胞培養後的培養基移至另一個細胞的培養皿內；(2)直接將兩種細胞培養在一起；(3)利用共同細胞培養容器，細胞與細胞的共同培養容器分成細胞直接接觸及間接接觸兩種培養容器，其中間接接觸的共同培養容器包含transwell type插入式細胞培養容器(cell culture insert)，但舊式的細胞共同培養容器因為transwell與insert為上下層的關係，因此無法同時觀察、攝影兩種活細胞在時間內的連續性變化(圖一)。

圖一、不同共同細胞培養的方式

    因此在近期發展出新一代的接續式細胞共同培養容器(Interactive Co-culture plate, ICCP)，透過重新設計的連接管，從垂直連接改成水平連接，細胞培養為兩側獨立的培養空間，因此研究人員在觀察細胞生長時，能夠同時並連續性紀錄兩種細胞的相互作用、細胞形態及生長變化等^[2]。

       先前文章「非侵入性產前檢測 (Non-Invasive Prenatal Testing，簡稱NIPT)」提及，在孕婦10週齡時，可以藉由抽取媽媽的血液分離出胎兒DNA，檢驗胎兒是否有染色體異常的疾病。然而，有些染色體異常的疾病是屬於小片段染色體缺失所導致，在非侵入性的檢測是無法檢查出來的，這些小片段染色體缺失疾病的臨床表徵有：發育遲緩、胎兒過小、胎兒生長停滯、神經系統發育不全、智能障礙、學習障礙、癲癇、肌肉張力低下、情緒障礙、臉部特徵異常、心血管系統先天異常、其他先天性發育異常…等。因此，醫學界發展出晶片是比較全基因體定量分析 (Array Comparative Genomic Hybridization, aCGH)，簡稱基因晶片檢測 (又稱羊水晶片檢測)，這種基因晶片能夠檢測微小基因片段缺失。

什麼是基因晶片？為什麼又稱羊水晶片呢？

       以矩陣的方式，將大量的基因探針 (Probe) 整齊排列於玻璃片上，而每個基因探針可以專一性辨識特定基因片段。因此，隨著基因探針的數量越多，能偵測的基因片段也就越多；但是在設計基因晶片時，基因探針的選擇相當重要，必須同時涵蓋重要的致病基因、偵測穩定度及再現性，這樣才能增加分析結果的可信度。羊水晶片顧名思義就是利用羊水中胎兒所剝落的細胞或其他可能含有DNA的廢物進行檢測。

圖一、晶片概念圖

先前提及進行羊膜穿刺會有流產的風險，為何還要利用羊水來進行基因晶片檢測呢？

    以往對抗腫瘤的方式包含手術、放療、化療、標靶治療等，而傳統化療的專一性較低，容易毒殺到其他健康的正常細胞，導致全身性的副作用。因而近期發產出新的第五大療法—免疫療法。免疫治療主要有三個大方向：(1)腫瘤疫苗、(2)細胞治療及(3)免疫檢查點抑制劑^[1]。其中，細胞治療又分成兩大類(圖一)，在本篇文章中主要介紹CAR-T的原理及臨床效益。

圖一、細胞免疫療法的分類

    CAR-T全名為Chimeric antigen receptor T-cell therapy，中文為嵌合抗原受體 T細胞療法，它不是一種藥物，而是細胞。首先，先簡介一下T細胞，T細胞是一種免疫細胞，主要在人體的功能為負責保護身體並抵抗外來病原的攻擊，而身體裡的T細胞又有不同種類，如：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、調節/抑制T細胞及記憶T細胞等，其中細胞毒性T細胞主要的功能為辨識並消滅受感染或突變的細胞。而CAT-T療法就是將無法辨識癌症的T細胞裝上一個名為CAR的雷達，接著細胞毒性T細胞就會像導彈一樣去毒殺腫瘤細胞^[2]。

CAR-T的原理

由於癌細胞源自身體正常的細胞，而人體的免疫系統不會攻擊自身組織，因此無法區分正常與癌細胞。在細胞毒性T細胞毒殺細胞或病原時，會先辨識細胞表面是否有兩種蛋白，第一類為組織相容性複合體(major histocompatibility complex, MHC)的蛋白複合體，另一類為共同刺激配體(co-stumulatory ligand)，其主要的作用是通知T細胞進行攻擊^[1]。利用基因工程讓模擬單株抗體結構(用於辨識抗原)的片段表現在T細胞受體上(T cell receptor, TCR)，同時再加上共同刺激因子(costimulating factor)，因此不需要透過樹突細胞來活化，直接讓T細胞活化具有攻擊癌細胞的能力(圖二)^[3]。

免疫檢查點抑制劑 (Immune checkpoint inhibitors，簡稱ICIs) 是腫瘤免疫治療的希望。與化療藥物不同，這些新型藥物對腫瘤細胞並不具有直接的細胞毒性，而是通過阻斷腫瘤對免疫系統的抑制、從而增強機體的內源性抗腫瘤免疫反應。ICIs是一種有效的新型抗癌藥物，已顯著延長了幾種難治癌症的生存，尤其黑色素瘤和非小細胞肺癌；此外，ICIs也納入多種實體腫瘤和血液惡性腫瘤的治療指南。

       ICIs於臨床上極有可能單獨或與其他藥物聯用，但以文獻指出，ICIs與其他藥物聯合使用治療效果較單一使用佳。相對地，聯合使用也帶來較高的副作用，如使用Anti-PD-1加Anti-CTLA-4與Anti-PD-1的副作用比例，前者約55%-60%，後者為10%-20%。除此之外，使用這些ICIs相對會帶來一些免疫相關的副作用 (Immune-related adverse event，簡稱irAEs)，有較高比例影響大腸、肝、肺、腦下垂體、甲狀腺和皮膚，也有少部分案例發生於心臟、神經系統和其他器官。這些副作用問題然是臨床上目前所面臨的瓶頸，甚至也影響著是否仍要將藥物合併使用。

       雖然免疫相關副作用 (irAE) 通常可以用皮質類固醇或其他免疫調節劑來控制，但仍有發生少數致命作用。然而，個別臨床試驗報告無法全面性描述這些少數的毒性效應，根據作者研究所知，沒有一個研究同時記錄超過9個致命作用。此外，與其他治療腫瘤的方法 (如化療、標靶治療、手術) 比較，免疫檢查點抑制劑 (ICIs) 所誘發致命毒性作用的發生率，目前仍不清楚的。未來是否提高ICI在臨床上使用率，作為輔助治療或更積極與其他藥物結合使用，甚至是否會危害生命或引發致命性的併發症，這些將成為臨床上跨學科所要面臨的問題。然而，這些致命irAE的發生頻率、範圍及臨床病徵都尚未明確定義。

       因此，本篇作者利用WHO藥物警戒數據庫 (Vigibase-Vigilyze)、國際多機構治療數據，以及描述超過750種致命性irAE的所有已發表臨床試驗作為研究依據，探討ICI相關毒性的發生頻率、範圍及臨床病徵。

       為了評估ICI相關致命毒性的影響範圍，作者從含有超過1600萬個案報告中，篩選出31059個與ICI相關的個案報告，整理出下方表格：

       根據美國中央情報局（CIA）的資料報導，台灣總生育率僅有1.13，在全世界排名中，位居倒數第三低，僅高於新加坡 (0.83) 與澳門 (0.95)。由此可知，我國國人生育意願並不高，其中影響因素眾多；然而，對有意願生育的國人來說，可能只生一至二個小孩，此時，父母對於小孩的健康就格外重視。提及健康，產檢就極為重要了，孕期過程會對胎兒進行一系列的檢查，如：發育完全與否、唐氏症及罕見疾病。

       在早期，要檢查胎兒是否有罹患唐氏症風險，大多以羊膜穿刺的方式，但其中伴有流產的風險。為了因應此風險，後期發展出一新興檢查方法–非侵入性產前檢測 (Non-Invasive Prenatal Testing，簡稱NIPT)。

檢測原理

       孕婦懷孕10週後，會有一部分的胎兒小片段DNA(fetal free DNA, ffDNA) 經由臍帶、胎盤，流到母體的血液裡，母體就有足量的ffDNA (可達10% 以上)，抽取母血離心後取血清的部分，並利用新一代高通量DNA定序技術將胎兒小片段DNA放大，進一步透過生物資訊學分析及醫生判讀，可以檢測腹中胎兒是否罹患常見染色體異常疾病。

主要檢測內容

       全世界肥胖的發生比例逐年上升，其中影響因素除了基因之外，也包含了飲食習慣等外在因素，使人體處於胰島素抗性的狀態，同時伴隨第二型糖尿病產生。在這過程，部分代謝機制的分子機制受到改變，而引起低度慢性發炎；其中促發炎細胞激素在體內的含量會增加，進而導致在骨骼肌、肝、腸道及脂肪組織的胰島素受體訊息傳遞受到阻礙。然而，腸道是負責飲食消化吸收和調控宿主免疫系統的主要器官，在這之中，腸道菌群也參與上述作用，而影響了腸道免疫平衡及滲透壓等。

       另外，美國蔓越莓（Vaccinium macrocarpon Aiton）是植物化學物質的重要來源，尤其是多酚 (Polyphenol)，並在北美廣泛消費。其中，多酚含量高與重要的抗氧化活性有關，這在胃腸生理學的背景下尤為重要。除了原先已知蔓越莓中花青素可以改善老鼠腸道黏膜層型態之外，蔓越莓也具有抗癌、抗發炎、抗菌 (主要是針對與尿道感染有關的P-fimbriated Escherichia coli，影響其表面疏水性和生物膜形成的變化)。而在代謝症候群中，蔓越莓可緩解個體血脂異常、高血糖及氧化壓力。

       因此，為了研究腸道菌群在肥胖所引起的相關代謝異常的疾病之重要性，作者利用高脂飲食 (HFHS) 來模擬肥胖及慢性發炎的狀態；同時，作者也加入蔓越莓萃取物 (CE) 測試是否會影響老鼠體內腸道菌群的組成。

圖一、蔓越莓萃取物對高脂飲食小鼠生理的影響

       結果顯示，餵食蔓越莓萃取物 (CE) 可以有效降低體重及脂肪含量，同時降低老鼠食慾。