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聚合酶鏈反應-單股核酸結構多樣性分析(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP),為近年來發展起來的一種基因分析方法[1]。其特性主要是透過單股核酸因序列的不同而自然形成不同的構形,因此在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳過程中,會有不同的移動速度。此技術廣泛應用於癌症基因抑癌基因突變的檢測遺傳病的致病基因分析基因診斷等領域[1]

其簡單的操作步驟如下[1]

1、非變性聚丙烯醯胺凝膠的製作

依照要分離的核酸片段大小及樣品數來決定凝膠的濃度與體積,一般使用凝膠的濃度為5~8%

2PCR產物的處理

反應總體積為10μl,在微量離心管中加入下列反應物:

  10×buffer

  dNTPmix

  DNA模板

  引子及Taq DNA酵素

  α-32P-dCTP  

  加ddH2O10μl

進行PCR擴增反應(根據樣品調整溫度Cycle)

接著再將PCR產物與變性loading dye 1:5的比例混合,loading樣本前以溫度98度變性10分鐘,接著立刻以冰浴處理。

3、電泳

根據PCR產物片段大小、電泳槽及凝膠大小,決定電泳的電壓電泳時間

4、偵測

電泳結束後,將凝膠固定於X線片夾中,在暗室中進行放射自顯影

其中容易影響PCR-SSCP結果的因素包含[1]

1、核酸片段大小

分析的核酸片段越小,檢測的敏感性越高。<200bp的片段,可偵測到其中70%的變異; 300bp左右的片段則,只能偵測到其中50%的變異;>500bp的片段,則僅能檢測出10%~3O%的變異,因此最適合的核酸片段大小為<300bP,其中以150bp左右的核酸片段最適合用於SSCP分析。

2、游離引子(primer)

游離引子可能會在結合上PCR產物,而影響核酸片段的構形,進而影響其電泳速度。因此,需要盡可能去除游離引子。

3、電泳溫度

一般都認為凝膠內溫度的恆定是SSCP分析最為關鍵的因素,溫度可能直接影響DNA分子內部分子結構的穩定性,並影響單股核酸的構形,進而影響電泳的結果。

目前有許多的科學研究都還是以SSCP做分析[2]

[1] PCR-SSCP技術在動物育種中的研究進展 [J]. 畜牧獸醫雜志 2005(03)

[2] 雞瘦蛋白受體(OBR)基因內含子8單核苷酸多態性與體脂性狀的相關研究 [J]. 遺傳學報 2004(03)

[3] 秦川牛、南陽牛雙肌基因的PCR-SSCP檢測 [J]. 中國農學通報 2003(05)

[4] 西藏牦牛、荷斯坦牛三個功能基因部分序列多態性的比較研究 [J]. 畜牧獸醫學報 2003(02)

[5] PCR-SSCP標記技術研究及應用進展 [J]. 山東科學 2002(04)

[6] Myostatin基因單核苷酸多態性的群體遺傳學分析 [J]. 遺傳學報 2002(07)

[7] PPAR基因單核苷酸多態與脂肪性狀相關的研究 [J]. 遺傳學報 2002(02)

[8] 雞脂肪酸結合蛋白基因的克隆和測序分析 [J]. 遺傳學報 2002(02)

[9] 雞細胞外脂肪酸結合蛋白基因單核苷酸多態性與腹脂性狀的相關研究 [J]. 中國科學(C:生命科學) 2001(03)

[10] 奶牛乳鐵蛋白基因部分序列的PCR-SSCP分析 [J]. 農業生物技術學報 2001(02)

接著再來看看PCR - SSCP的特點[3]

1PCR - SSCP 優點 :

A. 原理簡單、操作步驟少及週期短

B. 成本低,試劑價格相對較低

C. 適用於大量樣品的篩檢及基因突變研究做為篩檢的方式

D. 對於DNA材料的純度要求不高,且需要的樣品量不多

2PCR - SSCP 缺點 :

A. 無法檢測變異的位置

B. 隨著核酸產物長度的增加,靈敏度會下降

C. 假如突變所引起的構形改變不大,容易產生偽陰性的結果

  PCR-SSCP自從被科學家研究出來後,在方法學上一直被改善,在技術上也更加簡便,敏感度不斷地提高,並且被應用於許多的領域,如:疾病診斷、癌症篩檢、畜牧業、菌種鑑定、植物鑑定等。在未來PCR-SSCP或許能再搭配其他的方法學,補足其缺點,在各個領域發揮更大的作用。

 

 參考資料:

1. http://t.cn/RnjKZ01

2. 中國知網/中國期刊全文數據庫http://big5.oversea.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?filename=SWJT200706018&dbcode=CJFD&dbname=CJFD2007

3. PCR - SSCP 技術的研究進展 《上海畜牧獸醫通訊》 2002 年第 4 http://www.bjsycy.com/webedit/uploadfile/20088299342242.pdf

 

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