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    在過去華生與克利克在1953年解開DNA的雙股螺旋結構後(圖一),開啟了分子生物技術時代,不再是以巨觀及外在表徵去探討基因遺傳、家族性疾病及生物演化研究[1]

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圖一、DNA的雙股螺旋結構

    DNA是由碳氫磷所組成之去氧核醣核酸,主要組成包含四種核苷酸:A (腺嘌呤)、C (胞嘧啶)、G (鳥嘌呤)以及T (胸腺嘧啶),其中AT會配對在一起,GC會配對在一起,因此當雙股的DNA中一股為ATCGATCG,而另一股則為TAGCTAGC。但是如何去測定一段未知的DNA序列呢?

    在1975年,Sanger (桑格)發明了雙脫氧鏈終止法(圖二)[2],這個技術的原理為:在DNA合成的過程中,利用雙脫氧核糖核苷酸隨機終止DNA合成的過程,藉由分析終止的產物片段,反推其DNA序列。(看不懂的下面有詳細說明~~)

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圖二、Sanger定序法

    Sanger定續最關鍵的地方為,在合成DNA的過程中,聚合酶(合成DNA的酵素)會將脫氧核醣核苷酸聚合成DNA,所以當加入合成DNA的原料不是脫氧核醣核苷酸(dATP, dGTP, dCTP, dTTP),而是脫氧核糖核苷酸(ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)時,會導致DNA做到這個位置就停止,不能在往下繼續合成。

    因此透過這個原理,在PCR合成DNA的過程中分成四組(各別去偵測ATCG的位置),在合成原料中除了原本的脫氧核醣核苷酸(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)外,在四組中各別加入雙脫氧核醣核苷酸約(1:200倍;ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP其中一種,圖三),因此在合成的過程中,當加入的是ddATP時(偵測DNA上A的位置),會在DNA序列為A的地方停止(因此產生不同大小片段的DNA),因此再利用毛細管電泳分離(排列DNA片段大小),就可以知道DNA序列(由片段小往片段大的方向讀取,對應相對位置的ATCG,就能推得DNA序列)。

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圖三、各別偵測DNA序列中的ATCG位置

    Sanger定序法提供了DNA定序的基礎,之後衍伸出不同的定序技術,例如在ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)上標定不同螢光,讓定序更加快速且簡便。另外,在人類基因體計畫中,更是利用Sanger定序衍伸出來的霰彈槍定序法完成定序[1],因此可知Sanger定序法確實帶給分子生物技術突破性的發展及基石。

 

Edited by A-Kai

參考資料:

1. http://pansci.asia/archives/79940

2. https://smallcollation.blogspot.tw/2013/08/dnadna-sequencing.html#gsc.tab=0

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